钙离子荧光探针DiBAC4(3)是一种细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料，DIBAC4(3)本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，DIBAC4(3)进入细胞，细胞内荧光强度增加，即膜电位增加表示细胞去极化；反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化。钙离子荧光探针DiBAC4(3)是目前*常用的线粒体膜电位检测荧光探针。
1. 贴壁细胞
A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。
B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。
C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。
G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。
悬浮细胞
A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。
B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。
C. *后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。
F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左.
3
组织切片
A. 对于任何常见切片，处理至常规可以进行**染色时，或完成常规的**染色后，即可进行后续的Hoechst染色。
B. PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。可在六孔板中操作。
C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动。
D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
E. 将切片置于载玻片上，滴一滴抗淬灭封片液，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。
F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱，左侧峰为吸收光谱，右侧峰为发射光谱。