基本信息
货号：15276（assays）
储存条件：保存在冰箱并避光
适用仪器：酶标仪
简介
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定基于监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化。 NAD / NADH和NADP / NADPH的短紫外波长
分析使传统方法具有低灵敏度和高干扰。 AAT Bioquest的Amplite™比色总NADP / NADPH检测试剂盒为检测总NADP和NADPH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NADP / NADPH。无需从样品混合物中纯化NADP / NADPH。酶循环反应显着提高了检测灵敏度。 NADPH探针是一种生色传感器，在NADP减少时具有460nm的吸光度。 NADPH探针的吸收与溶液中NADPH的浓度成正比。 Amplite™比色总NADP和NADPH分析试剂盒提供灵敏的分析，可在100μL分析体积中检测低至0.03μM的总NADP / NADPH。与套件＃15260相比，该套件具有更高的灵敏度。
试剂盒组成
96孔板测定方案
简要总结
准备NADP / NADPH反应混合物（50μL）®
添加NADPH标准品或测试样品（50μL）®
在室温下孵育15分钟至2小时®®
监测460 nm处的吸光度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个
步骤
1.准备NADPH原液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中以制备1mM（1nmol /μL）NADPH储备溶液。
注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 oC。
2.制备NADP / NADPH反应混合物：
2.1将8 mL NADPH探针缓冲液（组分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
2.2将2 mL NADPH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。
注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以进行200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADPH标准品的连续稀释液（0至2μM）：
3.1将2μL的1mM NADPH储备液（来自步骤1）加入998μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，得到2μM（2 pmols / L）NADPH标准溶液。
注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL的2μMNADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0mM系列稀释的NADPH标准品。
3.3如表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微量培养板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。
表1：白色/透明底96孔微孔板中NADPH标准品和测试样品的布局
注意：NS = NADPH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。
表2：每个孔的试剂组成
*注意：将连续稀释的NADPH标准品（0.0313μM至2μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADPH（例如，>30μM，浓度）将导致饱和信号并使校准曲线非线性。
4.在上清液反应中运行NADPH测定：
4.1将50μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品的每个孔中（参见步骤3.3），使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔
注1：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNAP/ NADPH反应混合物。
注2：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分D）可用于裂解细胞。 （详见附录）。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3使用吸光度读板仪在460 nm处监测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。 NADPH标准曲线如图1所示。
图1。 使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices），在96孔白色/透明底板中用Amplite TM比色总NADP和NADPH测定试剂盒*增强灵敏度*测量NADPH剂量反应。 孵育1小时（n = 3）可以检测到低至0.03μM的NADPH，在460nm处测量吸光度。
附录：使用组分D（裂解缓冲液）的测试样品制剂
1.植物细胞样品：用200mg / mL的裂解缓冲液均质化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。
2.**细胞样品：离心收集**细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟.2500℃离心 转速5分钟，用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样品：从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液保持在室温下 15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。
4.组织样品：称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。
参考文献
1. Eugenia Villa-Cuesta, Marissa A. Holmbeckand David M. Rand. Journal of Cell Science (2014) 127, 2282–2290 doi:10.1242/jcs.142026.
2. Chao Tong, Alex Morrison, Samantha Mattison, Su Qian, Mark Bryniarski, Bethany Rankin, Jun Wang, D. Paul Thomas, and Ji Li. FASEB J, Nov 2013; 27: 4332 - 4342.
3. Rubin Tan, Jiansha Li, Xiaochun Peng, Liping Zhu, Lei Cai, Tao Wang, Yuan Su, Kaikobad Irani, and Qinghua Hu. Cardiovasc Res, Oct 2013; 100: 19 - 27.
4. Stephen Y. Xue, Valeria Y. Hebert, Danicia M. Hayes, Corie N. Robinson, Mitzi Glover, and Tammy R. Dugas. Toxicol. Sci., Aug 2013; 134: 323 - 334. 5. Kate J. Roberts, Andrew Cross, Olga Vasieva, Robert J. Moots, and Steven W. Edwards. J. Leukoc. Biol., Sep 2013; 94: 481 - 492.
5. Weijing Cai, Maya Ramdas, Li Zhu, Xue Chen, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. PNAS, Sep 2012; 109: 15888 - 15893.
6. Yue Qiu, Claus Tittiger, Claude Wicker-Thomas, Gaëlle Le Goff, Sharon Young, Eric Wajnberg, Thierry Fricaux, Nathalie Taquet, Gary J. Blomquist, and René Feyereisen. PNAS, Sep 2012; 109: 14858 - 14863.
8. Jaime Uribarri, Weijing Cai, Maya Ramdas, Susan Goodman, Renata Pyzik, Xue Chen, Li Zhu, Gary E. Striker, and Helen Vlassara. Potential role of AGER1 and SIRT1. Diabetes Care 2011; 34: 1610 - 1616.